Introduction
Laboratorium dan Teknis Pelaksanaan
Fasilitas yang diperlukan untuk Laboratorium Kultur Jaringan adalah :
1. Ruang persiapan
2. Ruang stok
3. Ruang transfer
4. Ruang kultur
5. Areal cuci
6. Areal persiapan aklimatisasi
7. Rumah kaca/rumah plastik
8. Nursery
Teknis Pelaksanaan di Laboratorium
A. Pembuatan Media MS
1. Siapkan 1 labu takar ukuran 1 L
2. Labu takar diisi dengan air destilata sebanyak 200 ml.
3. Stok dipipet sesuai dengan kebutuhan dan dimasukkan ke dalam labu takar.
4. Timbang gula sebanyak 30 g dan agar-agar sebanyak 7 g.
5. Gula dilarutkan dalam 200 ml air destilata dan kemudian dicampur ke dalam labu takar.
6. Volume ditepatkan hingga mencapai 1 liter.
7. PH larutan dengan pH meter atau kertas indikator pH. PH diusahakan 5,8-6.
8. Tuangkan larutan media dalam panci enamel besar, campurkan agar-agar kemudian didihkan sambil diaduk-aduk.
9. Tuangkan media dalam botol kultur setebal 1,5-2 cm.
10. Tutup botol kultur dengan aluminium foil atau tutup plastik khusus yang tahan panas.
11. Botol kultur disterilisasi dalam autoklaf selama 25-30 menit.
B. Sterilisasi eksplan (Salah satu alternatif )
1. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam cawan petri steril atau botol steril, tergantung dari ukuran eksplan yang digunakan.
2. Ke dalam botol steril dituangkan larutan Clorox 20% sampai bahan tanaman terndam. Kemudian dibiarkan selama 7 menit.
3. Sementara itu, cawan petri lain dengan air steril disiapkan.
4. Setelah direndam selama 7 menit dalam Clorox 20%, bahan tanaman dibilas dalam air steril di cawan petri kedua selama 5 menit.
5. Bahan tanaman dimasukkan ke dalam larutan Clorox 10% selama 10 menit kemudian dibilas dengan air steril selama 5 menit.
6. Bahan tanaman direndam lagi dalam larutan Betadine 0.25% selama 3-5 menit.
7. Bahan tanaman dibilas dua kali dalam air steril dengan lama perendaman masing-masing 5 menit agar sisa-sisa Betadine pada eksplan dapat larut.
8. Bahan tanaman ditanam dalam media dengan menggunakan alat-alat yang sudah disterilkan.
C. Penanaman
1. Alat-alat dan lampu alkohol diletakkan agak di sebelah kanan. Lampu alkohol diusahakan tidak terlalu dekat dengan wadah alkohol maupun filter.
2. Sebelum mengambil bahan tanaman, pinset dicelupkan ke dalam alkohol 95% kemudian di bakar sampai alkohol yang melekat di pinset terbakar habis. Setelah itu didinginkan dengan cara meletakkannya di atas cawan petri steril.
3. Media tumbuh disiapkan. Tutupnya (alumunium foil) dibuka dengan hati-hati supaya bagian dalam tutup (alumunium foil) tidak tersentuh. Tutup tersebut diletakkan di bagian kiri tempat kerja, dalam keadaan dalamnya menghadap ke atas ( dalam keadaan terlentang).
4. Botol dipegang dengan tangan kiri dalam keadaan miring. Mulut botol dibakar di atas api alkohol. Ketika membakar mulut botol, sebaikanya botol diputar dengan titik tengah lingkarannya sebagai poros agar seluruh bagian mulut botol terkena api secara merata. Pemutarannya dilakukan dengan hati-hati secara perlahan-lahan.
5. Dengan pinset steril yang sudah dingin, eksplan diambil dan dimasukkan ke dalam media.
6. Sebelum ditutup, mulut botol dan bagian dalam tutupnya (jika menggunakan alumunium foil) sebaiknya dibakar dulu.
7. Tutup botol dikencangkan dengan menggunakan karet gelang.
8. Label ditulis kemudian ditempelkan pada tutup.
Label ini berisi:
- Jenis tanaman (cukup kode).
- Bagian tanaman: daun, anther, pucuk, akar, dan sebagainya.
- Nama media (cukup kode).
- Tanggal penanaman.
9. Larutan HgCl2, bekas dikumpulkan dalam sebuah wadah kemudian dibuang di suatu tempat yang tidak akan mencemarkan sumber air minum, atau diuapkan sehingga diperoleh garam HgCl2 kembali.
D. Aklimatisasi
1. Perakaran planlet diperiksa: apakah terbentuk dari pucuk atau kalus; apakah sudah terbentuk bulu-bulu akar. Bulu-bulu akar lebih baik perkembangannya di media cair.
2. Planlet yang vitrous tidak akan tahan dikeluarkan dari botol, hanya planlet yang hijau kekar yang dapat bertahan. Oleh karena itu, harus dilakukan seleksi kultur.
3. Kultur yang akan dikeluarkan diberi intensitas cahaya yang tinggi selama 1-2 minggu.
Pada proses pemindahan, tindakan berikut perlu dilakukan:
1. Semua agar-agar dan bekas media dari planlet dicuci bersih karena media in vitro mengandung gula yang menarik serangga dan serangan penyakit.
2. Pada waktu pencucuian, diusahakan agar akar tidak sampai terputus.
3. Setelah dicuci, agar-agar dan bekas media dari plantlet direndam dalam larutan fungisida 2 g/l selama 30 menit.
4. Media tanam berupa kompos : pasir =1:1 (v/v) sebaiknya media steril/semi steril.
5. Setelah plantlet ditanam dalam pot kecil atau polibag kecil, tanaman disungkup dengan sungkup plastik. Sungkup plastik dapat secara individu maupun untuk beberapa pot.
6. Plantlet diletakkan pada tempat dengan intensitas cahaya 40-59%.
7. Temperatur aklimatisasi antara 25-30 0C. Temperatur lebih dari 30 0C dapat menyebabkan kematianplantlet. Pengaturan temperatur dapat dilakukan dengan penyiraman air secara berkala di atas sungkup.
8. Setelah 10-14 hari, sungkup dibika. Bila kelayuan plantlet masih terjadi , sungkup harus digunakan kembali. Setelah plantlet segar, sungkup dibuka kembali sampai akhirnya plantlet tidak perlu disungkup lagi.
9. Plantlet yang telah menunjukkan pertumbuhan dipindahkan ke nurseri dengan intensitas cahaya yang lebih tinggi. Setelah kuat, tanaman dipindah ke lapangan.
|
